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发酵豆粕真正品质评判的测定方法解析

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发表于 2019-7-10 10:33:08 | 显示全部楼层 |阅读模式
发酵豆粕中的小肽与抗原蛋白是衡量品质优劣的两项重要指标,长期以来国内的发酵豆粕产品主要由乳酸菌通过厌氧发酵生产,而出于便捷考虑,业内通常使用酸溶蛋白法测定小肽含量,使用ELISA法测定抗原蛋白含量,但随着发酵豆粕使用普遍性提高,并且芽孢杆菌通过有氧发酵生产的发酵豆粕在国内市场上渐露锋芒,这两种测定方法是否适用,是否能作为客观反映小肽和抗原蛋白真实含量的指标,引起了关注与讨论。


  1 小肽-酸溶蛋白法


  ①不同pH 发酵(或酶解)的豆粕在酸中的溶解度不同
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  微生物发酵过程中对蛋白质的分解,实质上就是微生物产蛋白酶的作用。但是,不同酸碱性的蛋白酶酶解豆粕所得的小肽在酸中的溶解度不同,其中酸性蛋白酶酶解小肽高达96%可以溶于三氯乙酸,而碱性蛋白酶酶解小肽不到 50%。因此,酸溶蛋白更适合评估酸性发酵或酶解的豆粕产品,将低估希杰速益肽这类芽孢杆菌发酵的中偏碱性产品的小肽含量(刘慧珍,江南大学硕士论文,2007)。速益肽 55%CP 产品酸溶蛋白相对低(6-10%)。


  ②小肽应有明确的分子量定义


  食品国家标准《大豆肽粉GBT 22492》2008 版将小肽的定义由<10 KDa 降低到<5 KDa。营养学上关于小肽的定义稍有差别,但是以分子量范围来定义是共识。高效凝胶过滤色谱法(HPLC)是小肽含量和蛋白分解程度测定的“黄金标准”。该方法以多孔性填料为固定相,依据样品组分分子体积大小的差别进行分离,在肽键的紫外吸收波长214nm 条件下检测,使用凝胶色谱测定分子量分布。研究也表明,发酵豆粕中大分子蛋白的分解程度(蛋白质和肽的分布)与仔猪小肠绒毛结果和生长性能相关(张露露等,2016)。传统的酸溶蛋白不能区分蛋白氮、游离氨基酸氮和非蛋白氮,也不能给出明确的分子量。


  ③酸溶蛋白只体现了速益肽小肽含量的一小部分


  希杰研究所实验发现,同时测定的发酵豆粕样品整体蛋白分布(红色峰)和三氯乙酸溶解后上清液的蛋白分布结果(蓝色峰)。三氯乙酸提取的分子量5kDa 以下蛋白质部分,而红色图谱和蓝色图谱之间存在一个灰色的面积区域是三氯乙酸没有办法提取出来的样品中的肽含量的部分,即三氯乙酸并不能完全溶解出样品中的所有的肽,只能溶解出其中的一小部分(如下图)。


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  2 抗原蛋白-ELISA 法和SDS 法


  ①ELISA 法测定加工豆类产品的缺陷


  致敏性不确定:目前已有商品化大豆抗原蛋白的检测试剂有大豆球蛋白检测试剂盒和β-伴大豆球蛋白检测试剂盒,但是另两种大豆抗原蛋白 Gly m Bd 30K 和 Gly m Bd 28K 并没有商品化试剂盒。这两种抗原蛋白分别被 65%和 25%的大豆过敏病人血清识别。目前商品化的β-伴大豆球蛋白的α亚基与α’亚基、β亚基之间有很高的同源性,分别为 90.14 和 76.2%,但是α’亚基、β亚基并不是致敏蛋白。


  变异大:目前主流的商品化试剂盒法不适用于热加工后大豆产品。首先热加工过程中,蛋白变性和美拉德反应都将影响产品中的抗原萃取率,而当前主流商品化试剂盒中使用的Tris-Hcl 萃取液实际的抗原萃取率不到50%,且变异大(如下图)。


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  假阳性:目前主流的商品化试剂盒法在测定发酵或酶解后的大豆产品也存在争议。大豆抗原蛋白亚基(导致抗原活性的基础)在分解过程中,一方面通过降解减少抗原活性,另一方面也将导致更多的抗原表位暴露,从而增加“所谓”的抗原活性,但是这种活性是否能引起过敏反应仍不清楚。一般认为抗原分子量一般在10 KDa 以上,具有良好抗原活性其分子量需超过500 KDa。传统的营养学理论也认为只有完整的抗原亚基进入血液才能导致致敏反应。因此希杰认为SDS 是鉴定抗原降解的有效方法,并以最小亚基分子量30 KDa 作为豆粕降解标准,如下图。


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  ②ELISA测定食品抗原问题探讨


  影响因素:


  · 提取方法;


  · 水解或发酵;


  · 热加工;


  · 交叉反应


  结论:


  · FDA(2005)认为多数ELISA方法可能并不适用;


  · ELISA检测不出也不能判断无抗原活性,建议用Western判定


  ③SDS 电泳测定抗原的注意事项


  抗原萃取率:不同溶剂对大豆抗原的萃取结果差异很大,高温使发酵豆柏表层蛋白变性,并发生美拉德反应,Tris-HCl 提取液不能将被变性蛋白包裹的抗原蛋白提取出来。而碱性溶液萃取率较好,其中氢氧化钾对大豆蛋白的萃取率约70%,尿素的萃取率最佳(80~90%)。


  上样蛋白浓度:发酵豆粕产品因加工工艺差异较大,即使用萃取率最高的试剂进行萃取,萃取率也是有较大差异的,因此SDS 电泳测定各产品的抗原前,需要确定上样样品的蛋白含量是否一致,以校正萃取率的差异,否则将出现萃取率高的产品条带多。希杰速益肽分解程度高,采用低温干燥,热损伤低,萃取率高;而部分高温处理产品萃取率较低,从而导致测定假象(见下图,某国际知名农牧企业提供)。


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  希杰推荐的蛋白浓度测定方法如下:将离心后样品稀释20X,取50μL 与950μL BCA 反应液混匀(20X 倍数关系),放置在37℃恒温箱30min。反应结束后测定562nm 的吸光度。用已知不同浓度的BSA(牛血清蛋白0、0.25、0.5、1、1.25mg/mL)与BCA 混合(20X 倍数关系,同上)后于37℃恒温箱30min 反应后的吸光度求校正曲线及其方程。计算得出样品中40ug 蛋白含量的点样量。

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